摘 要：靈芝具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗病毒、保護(hù)肝臟等多種生物活性，但由于野生靈芝稀少，固體培植靈芝周期長(zhǎng)，利用液體發(fā)酵靈芝菌絲體，是目前重要的發(fā)展方向。

關(guān)鍵詞：靈芝、靈芝菌絲體、液體發(fā)酵

靈芝俗成靈芝草，古稱(chēng)瑞草，為擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，是我國(guó)著名的藥用真菌。靈芝作藥用具有悠久的歷史，《列子》中就有”朽壤之上有南芝者”的記載，并總結(jié)了靈芝治病的經(jīng)驗(yàn)：”煮百沸其味清芳，飲之明目、腦清、心靜、腎堅(jiān)，其寶物也”。靈芝含有多種活性成分，如多糖、靈芝酸、甾醇、核苷、生物堿、蛋白質(zhì)、脂肪酸等。

靈芝的人工生產(chǎn)主要有固體培養(yǎng)法和液體發(fā)酵法。固體培養(yǎng)法取材方便，經(jīng)濟(jì)有效，可長(zhǎng)出子實(shí)體，是一種有效獲取靈芝產(chǎn)品的方法；但固體培養(yǎng)法存在周期較長(zhǎng)，且較難有效地確定培養(yǎng)終點(diǎn)和嚴(yán)格控制產(chǎn)物的含量和質(zhì)量等缺點(diǎn)。液體發(fā)酵方法不受季節(jié)的影響，培養(yǎng)周期短，且成本低，能快速增殖菌體細(xì)胞，有效成分和活性物質(zhì)的產(chǎn)生易于控制等優(yōu)點(diǎn)，受到人們的廣泛關(guān)注。研究表明，液體發(fā)酵生產(chǎn)的靈芝多糖與來(lái)源于靈芝子實(shí)體和靈芝孢子的多糖具有相近的功效^[1]。

靈芝屬種質(zhì)資源十分豐富，我國(guó)就有近百種，目前對(duì)靈芝的研究主要集中在赤芝（Ganoderma lucidum）和松杉靈芝（Ganoderma tsugae）兩個(gè)種上，還有大量的物種資源尚待開(kāi)發(fā)^[2]。對(duì)這些靈芝種進(jìn)行選育和液體發(fā)酵馴化，是獲得高產(chǎn)多糖或三萜菌種的手段之一。目前對(duì)G.lucidum，G.Oerszedii，G.resinaceum，G.subamboinense，G.tsugae5個(gè)種的20余個(gè)菌株進(jìn)行液體發(fā)酵的研究發(fā)現(xiàn)，這五個(gè)種在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生靈芝多糖和靈芝三萜的量、分子量分布和單糖等組成比較接近^[3]。

就同一種而言，菌株差異對(duì)三萜和多糖的產(chǎn)量也有顯著影響。如在對(duì)上述5個(gè)種20余個(gè)菌株進(jìn)行發(fā)酵研究后發(fā)現(xiàn)，菌絲體生物量最多達(dá)到12.1g/L（G.resinaceum 菌株），而最少G.tsugae菌株只有3.2g/L；多糖含量在同一G.tsugae種的不同菌株間差別也很大，最高可達(dá)58.1％，最低至30％；而三萜乙醇提取物在各個(gè)種、各菌株間含量差別不大，在11.6％至17.0％之間，但功效和活性差異較大^[4]，因此，在發(fā)酵中使用經(jīng)篩選的特定菌株也是提高產(chǎn)量的一條有效途徑。

在靈芝發(fā)酵生產(chǎn)中，培養(yǎng)基組分的變化會(huì)影響靈芝菌絲體和活性成分的產(chǎn)生。培養(yǎng)基主要由碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和生長(zhǎng)因子組成，適當(dāng)?shù)呐浔群蚿H對(duì)靈芝菌絲體發(fā)酵以及多糖的產(chǎn)量有重要影響。

靈芝液體發(fā)酵所需的碳源來(lái)源廣泛，常見(jiàn)的有葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖、玉米粉等。劉冬等^[5]對(duì)15種常用碳源進(jìn)行篩選研究，發(fā)現(xiàn)最適碳源單糖為葡萄糖，二糖為蔗糖，多糖為玉米粉、小麥面粉、麩皮粉或土豆粉。靈芝菌絲體的生長(zhǎng)速度，在葡萄糖為碳源的液體培養(yǎng)基中最快，蔗糖次之，多糖最慢。一般認(rèn)為復(fù)合有機(jī)碳源更有利于靈芝菌及其次生代謝產(chǎn)物的生成。李平作等^[6]研究顯示，除葡萄糖外，在培養(yǎng)基中添加組分較復(fù)雜且富含半纖維素、纖維素的復(fù)合碳源如玉米粉、酒糟等可獲得較好的發(fā)酵效果。復(fù)合碳源具有來(lái)源廣泛易得、成本低廉的優(yōu)勢(shì)，適應(yīng)產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)的需求。

氮源主要是合成靈芝真菌細(xì)胞核酸、蛋白質(zhì)及次生代謝產(chǎn)物不可或缺的物質(zhì)基礎(chǔ)。劉冬等^[5]報(bào)道，用酵母膏、黃豆餅粉、花生餅粉、蛋白胨等有機(jī)氮源進(jìn)行靈芝液體發(fā)酵時(shí)，菌絲體的產(chǎn)量明顯高于無(wú)機(jī)氮源，可見(jiàn)靈芝菌絲體對(duì)有機(jī)氮源的利用能力要優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源。Hsieh CY^[7]研究表明，蛋白胨和酵母提取物對(duì)于靈芝菌絲體的生長(zhǎng)促進(jìn)作用顯著，但用量過(guò)高會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)量。常景玲^[8]報(bào)道，將麩皮(5%)和蛋白胨(0.3%)搭配作為氮源，比單一的麩皮或蛋白胨作為氮源對(duì)菌絲體與多糖的產(chǎn)生更有利。

培養(yǎng)基除考量碳、氮源的組成外，碳、氮源濃度及合適的碳氮比也是需要著重考慮的。只有二者均在合適的濃度下，菌絲體才能兼顧生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物的形成。李平作等^[19]報(bào)道，較高的C/N有利于靈芝多糖的生成；在C/N確定時(shí)，過(guò)高濃度的碳源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)存在抑制作用，影響發(fā)酵周期；氮源濃度對(duì)發(fā)酵的周期影響不大，但對(duì)靈芝多糖及靈芝酸的產(chǎn)量存在一定影響。劉冬等^[5]研究認(rèn)為，最佳碳氮比為23.6～31.1。Hsieh CY^[7]試驗(yàn)證實(shí)，供給充足的碳源是保證菌絲體中多糖產(chǎn)量的關(guān)鍵。羅建成等^[9]報(bào)道，靈芝菌絲體生物量和胞外多糖含量在一定的范圍內(nèi)隨著葡萄糖含量增加而升高，但當(dāng)葡萄糖含量大于5%時(shí)，靈芝菌絲體的生長(zhǎng)將受到抑制。

靈芝在液體發(fā)酵過(guò)程中需要添加少量的無(wú)機(jī)鹽，如磷、鉀、鎂、硫和鈣等，菌絲生長(zhǎng)的最基本元素為磷、鉀和鎂，磷參與糖代謝，鎂離子參與菌體生長(zhǎng)，鉀對(duì)糖酵解有促進(jìn)作用。劉冬等^[5]報(bào)道，培養(yǎng)基中Mg²⁺、P⁵⁺缺乏對(duì)菌絲體生物量影響較大，而K⁺缺乏時(shí)菌絲體幾乎不生長(zhǎng)。Hsieh CY^[7]研究發(fā)現(xiàn)，磷酸鹽缺乏可導(dǎo)致胞內(nèi)多糖產(chǎn)量顯著降低，而限量添加Mg²⁺則會(huì)獲得較低含量的大分子多糖。其它一些無(wú)機(jī)鹽，如鈣離子，一般使用碳酸鈣調(diào)節(jié)發(fā)酵液酸堿度；硒和鋅等元素，靈芝可將這些無(wú)機(jī)態(tài)的礦質(zhì)元素生物富集，轉(zhuǎn)化成有機(jī)態(tài)的礦質(zhì)元素，更易于吸收利用。魏賽金等^[10]探討了在培養(yǎng)基中添加不同濃度的Zn²⁺對(duì)靈芝菌絲生長(zhǎng)和液體發(fā)酵富集Zn²⁺的影響。胡志斌等^[11]就不同水平亞硒酸鈉對(duì)靈芝液體發(fā)酵的影響進(jìn)行了研究，數(shù)據(jù)顯示液體發(fā)酵培養(yǎng)基中硒濃度為250μg/mL時(shí)獲得的菌絲體生物量最高。

靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)需要一定量維生素類(lèi)物質(zhì)，特別是維生素VB₁(硫胺素)，必需從外界補(bǔ)充，其對(duì)靈芝菌絲體生長(zhǎng)和生物活性物質(zhì)生成具有重要作用。胡煥榮^[12]研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入150mg/L維生素B₁，能促使靈芝菌絲體生長(zhǎng)粗壯。陳芳莉等^[13]研究了維生素與靈芝菌絲體生長(zhǎng)及其胞外多糖生成間的關(guān)系，結(jié)果表明，VB₂與VB₆對(duì)菌絲體生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用，且可使其生成較多的胞外多糖，VB₂較VB₆作用更為明顯。據(jù)陳志玲等^[14]報(bào)道，液體培養(yǎng)時(shí)加入適量的復(fù)合VB、VB₁、鐵和鋅可使靈芝多糖及靈芝酸產(chǎn)量顯著提高。

接種量對(duì)菌絲生長(zhǎng)有較大影響。接種量較低，菌絲生長(zhǎng)速度慢，將延長(zhǎng)發(fā)酵周期；接種量高則會(huì)競(jìng)爭(zhēng)有限的營(yíng)養(yǎng)，造成生長(zhǎng)過(guò)剩，氧氣不足，菌絲老化，不利于有效成分的積累。但接種量對(duì)最終菌絲干重影響不大，在不考慮培養(yǎng)時(shí)間的前提下，在各個(gè)不同的接種濃度時(shí)最終得到的菌絲量差別不大^[15]。但接種量對(duì)靈芝多糖和靈芝酸的產(chǎn)量是有影響的。搖瓶培養(yǎng)時(shí)，大量接種（670mgDW/L）可以獲得較高的多糖產(chǎn)量，而低的接種濃度（170mgDW/L）能得到較多的靈芝酸產(chǎn)量^[16]。

一般培養(yǎng)靈芝的適宜pH范圍為5.0～6.5，但針對(duì)不同產(chǎn)物的最適初始pH并不相同。以菌絲體生物量和靈芝酸為目標(biāo)產(chǎn)物時(shí)，初始pH最佳為6.5左右^[17]。以多糖產(chǎn)量為目標(biāo)產(chǎn)物時(shí)，則最適pH在3.5～6.0之間，適當(dāng)降低培養(yǎng)基的初始pH可提高多糖產(chǎn)量^[18]。李平作等研究了靈芝發(fā)酵過(guò)程中pH的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)適合胞外多糖產(chǎn)生的pH與適合菌絲生長(zhǎng)的pH不一致，若在發(fā)酵過(guò)程中控制pH在4.0，可提高胞外多糖產(chǎn)量24％^[19]。

靈芝發(fā)酵的適宜溫度范圍較廣，在22～35℃內(nèi)均可生長(zhǎng)，但最佳的生長(zhǎng)溫度范圍要窄一些，并且合適的菌絲生長(zhǎng)溫度與多糖和三萜的產(chǎn)生溫度不一致?？紤]到菌株差異及其它發(fā)酵因素的影響，合適的菌絲生長(zhǎng)溫度在25～28℃范圍內(nèi)^[20]。提高溫度（27～30℃），則能提高多糖和三萜的產(chǎn)量^[21]。

靈芝發(fā)酵過(guò)程中，溶氧的控制是很重要的因素之一。氧氣供應(yīng)在發(fā)酵工業(yè)上是通過(guò)通氣和攪拌實(shí)現(xiàn)，過(guò)高和過(guò)低的通氣和攪拌不利于靈芝發(fā)酵。李平作等發(fā)現(xiàn)在25L發(fā)酵罐內(nèi)，提高攪拌轉(zhuǎn)速可使產(chǎn)生的菌球小而多糖含量高^[6]，加大通風(fēng)量可增加最終生物量^[18]；較低的溶氧環(huán)境可促進(jìn)靈芝酸的產(chǎn)量^[22]。

隨著靈芝產(chǎn)品的應(yīng)用日益廣泛，其需求量不斷增加，采用液體發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)靈芝，在一定程度上克服了采收野生靈芝和栽培靈芝的局限性。隨著微生態(tài)學(xué)、生物工程學(xué)、發(fā)酵工程技術(shù)等學(xué)科的發(fā)展，以及各學(xué)科間相互交叉，靈芝液體發(fā)酵技術(shù)的研究與應(yīng)用，將得到更為廣闊的發(fā)展。

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