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甲醇營(yíng)養(yǎng)型巴斯德畢赤酵母的認(rèn)識(shí)
酵母是單細(xì)胞真核微生物，其遺傳操作簡(jiǎn)單，對(duì)翻譯后的蛋白質(zhì)有加工修飾的能力，因此在生物技術(shù)表達(dá)外源蛋白方面是一個(gè)很有吸引力的表達(dá)系統(tǒng)。與原核表達(dá)系統(tǒng)如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等相比，酵母有先進(jìn)的外源蛋白折疊系統(tǒng)、較強(qiáng)的分泌能力和后加工能力；與動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比，酵母可以在簡(jiǎn)單的合成培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并且生長(zhǎng)速率快、成本低。酵母表達(dá)系統(tǒng)中主要有常規(guī)的釀酒酵母和非常規(guī)的酵母，后者主要有以甲醇為唯一碳源能源的甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母和能以乳糖為唯一碳源能源的乳酸克魯維酵母。我們公司用于發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶的菌株就是屬于甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母的巴斯德畢赤酵母，該酵母在近年的研究中表現(xiàn)出很廣泛的應(yīng)用前景。
巴斯德畢赤酵母的生物學(xué)特點(diǎn)
畢赤酵母屬的細(xì)胞呈短橢圓行或圓柱形，多邊芽殖，有些種形成假菌絲，有性繁殖時(shí)會(huì)形成子囊孢子。巴斯德畢赤酵母是一種可以在以甲醇為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的酵母菌，因?yàn)槠浼?xì)胞中的過(guò)氧化物酶體中含有甲醇代謝途徑的必需酶，如醇氧化酶、二羥丙酮合成酶和過(guò)氧化氫酶等，其中醇氧化酶（AOX）是甲醇利用途徑中的第一個(gè)酶，該酶受到葡萄糖、甘油和乙醇等碳源的阻遏。
甲醇營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母在以甲醇為唯一碳源生長(zhǎng)時(shí)，首先甲醇在醇氧化酶的作用下被氧化成甲醛和過(guò)氧化氫，然后甲醛被氧化成甲酸，并生成二氧化碳，過(guò)氧化氫則在過(guò)氧化氫酶的作用下變成水和氧氣；另外，生成的甲醛還可以通過(guò)木酮糖單磷酸途徑被同化成磷酸二羥丙酮和磷酸甘油醛。這兩種代謝途徑都能為細(xì)胞生長(zhǎng)提供能量和細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)。
甲醇營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母的優(yōu)勢(shì)
甲醇營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母與重組釀酒酵母比較具有以下優(yōu)勢(shì)：
(1)具有精確調(diào)控的啟動(dòng)子，可以精確表達(dá)目的外源蛋白；
(2)表達(dá)效率高，其表達(dá)的外源蛋白可占總表達(dá)蛋白的90％以上，有利于目的蛋白的分離純化；
(3)在簡(jiǎn)單合成培養(yǎng)基中可實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)；
(4)由于該酵母可以以甲醇為唯一的碳源和能源，而絕大多數(shù)微生物并不能以甲醇為碳源，這樣就可以極大程度地降低雜菌在發(fā)酵液中的繁殖量，減小其對(duì)正常發(fā)酵的不利影響。因此，甲醇營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母是近年來(lái)作為表達(dá)外源目的蛋白最有前途的表達(dá)系統(tǒng)。
外源蛋白在甲醇營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母中的表達(dá)
畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)外源蛋白的過(guò)程一般包括3個(gè)階段：(1)細(xì)胞增殖階段，細(xì)胞在含有易利用碳源（如葡萄糖、甘油等）的培養(yǎng)基中快速繁殖以積累生物量；(2)分批流加的過(guò)渡階段，在此階段中向培養(yǎng)基中限制性流加葡萄糖、甘油等碳源，進(jìn)一步積累細(xì)胞量，為誘導(dǎo)表達(dá)做準(zhǔn)備；(3)誘導(dǎo)表達(dá)階段，以限制性速率流加甲醇或甲醇與葡萄糖、甘油等的混合液，誘導(dǎo)表達(dá)外源目的蛋白。各階段碳源都為限制性基質(zhì)，其補(bǔ)加速率的動(dòng)力學(xué)模型是高效表達(dá)的基礎(chǔ)。
應(yīng)用前景及局限性
巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的諸多優(yōu)勢(shì)使之越來(lái)越受到關(guān)注，其研究?jī)r(jià)值和商業(yè)價(jià)值亦不斷體現(xiàn)。在載體構(gòu)建和新型菌株的開(kāi)發(fā)方面，已經(jīng)取得了卓有成效的研究成果。但是作為一種新的表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母也存在一些不足之處，如發(fā)酵周期長(zhǎng)；利用易燃易爆有毒的甲醇做原料，生產(chǎn)過(guò)程和表達(dá)產(chǎn)物的衛(wèi)生安全性需要考慮；篩選高產(chǎn)菌株需用的藥物價(jià)格比較昂貴，也給生產(chǎn)應(yīng)用帶來(lái)局限；另外，表達(dá)過(guò)程的控制和培養(yǎng)基配方等尚有待于進(jìn)一步開(kāi)展開(kāi)創(chuàng)性的探索研究，突破傳統(tǒng)培養(yǎng)發(fā)酵模式，優(yōu)化培養(yǎng)基配方，為提高外源蛋白的表達(dá)量作出積極有益的探索。因此還需要對(duì)此表達(dá)系統(tǒng)做更深入的研究，相信隨著對(duì)甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母表達(dá)機(jī)制的進(jìn)一步了解，在不久的將來(lái)它必將在分子生物學(xué)以及工業(yè)發(fā)酵的各個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。
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